Adjustment of Protocol for the Extraction of Cowpea DNA
DOI:
https://doi.org/10.17921/1415-6938.2025v29n2p299-311Abstract
The use of DNA extraction protocols provides genetic material with high quality, quantity, stability and purity. Thus, the objective of this study was to adjust the protocol for DNA extraction of leaf tissue from cowpea (Vigna unguiculata). Adjustments were made to the DNA extraction protocol using CTAB (cetyltrimethylammonium bromide). The variables tested were CTAB (2%, 3%, 4% and 5%), β-mercaptoethanol (1% and 1.5%), Polyvinylpyrrolidone (2% and 3%), mechanical maceration of plant tissue for 30 s, 1 min and 2 min, and manual maceration (with a pistil and glass rod); liquid nitrogen and incubation in a water bath (30 min and 1 h). The results show that the 5% concentration of CTAB was more efficient, and it is thus recommended for DNA extractions of this species. The different concentrations of β-mercaptoethanol did not interfere with the result. Mechanical maceration using TissueLyser II at 1 min was efficient for good quality DNA extraction. The use of liquid nitrogen in the maceration was essential for the integrity of the genetic material. The reduction in water bath time resulted in time savings though did not affect DNA quality. The ISSR primer evaluated amplified regions of the genome and proved the efficiency of the extraction.
Keywords: Vigna unguiculata. CTAB. Liquid Nitrogen.
Resumo
A utilização de protocolos de extração de DNA deve propiciar a obtenção de material genético com alta qualidade, quantidade, estabilidade e pureza. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi adequar o protocolo para a extração de DNA de tecido foliar de feijão-caupi (Vigna unguiculata). Genótipos da Embrapa de feijão-caupi foram cultivados para a extração de tecido jovem. Ajustes foram realizados a partir do protocolo de extração de DNA utilizando CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio). As variáveis testadas foram CTAB (2%, 3%, 4% e 5%); β-mercaptoetanol (1% e 1,5%); Polivinilpirrolidona (2% e 3%); maceração do tecido vegetal (mecânica) nos tempos de 30s, 1 min e 2 min, e manual (com pistilo e bastão de vidro); presença ou ausência de nitrogênio líquido e tempo de incubação em banho-maria (30 min e 1 h). Os resultados demonstraram que a concentração de CTAB de 5% foi a mais eficiente, sendo indicada para extração de DNA da espécie. As diferentes concentrações de β-mercaptoetanol não interferiram no resultado. A maceração mecânica utilizando TissueLyser II a 1min mostrou-se eficiente para extrair DNA com boa qualidade. A utilização de nitrogênio líquido na maceração foi imprescindível para a integridade do material genético. A redução no tempo de banho-maria resultou na economia de tempo sem afetar a qualidade do DNA. O primer ISSR avaliado amplificou regiões do genoma, comprovando a eficiência da extração.
Palavras-chave: Vigna unguiculata. CTAB. Nitrogênio Líquido.
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